SEC方法流动相配制指南
引言
日常的液相实验操作中,流动相配制是实验技术人员需要掌握的基础。流动相的选择和配制不仅影响样品的溶解度和分离效果,还直接关系到色谱柱的寿命和仪器的使用性能。因此,掌握流动相的配制技巧对于获得准确的色谱分析结果至关重要。
本期我们以体积排阻色谱(Size-Exclusion Chromatography,SEC)为例,与大家分享一些流动相配制方面的技巧小贴士,帮助大家获得稳定可靠的分析结果。
流动相选择
生物大分子的SEC方法,最常用的流动相是磷酸缓冲盐。通常情况下,SEC的分离效果不受流动相的影响。若峰形受到静电吸附作用及疏水作用的影响,造成拖尾或出峰异常等现象,则可以在流动相中加入高盐或有机试剂来进行改善。常用的有机试剂包括:异丙醇、乙腈等。
选择要点
1.样品在选用的流动相中有较好的溶解性和稳定性;
2.流动相需在色谱柱的耐受范围内使用,包括流动相的pH、有机相比例等。通常硅胶基质的SEC色谱柱,耐受流动相的pH范围为2.0~8.0,如需在缓冲盐中加入有机试剂,有机试剂的添加比例需控制在20%以内。
配制步骤
1.150mM PB缓冲盐:
称取Na₂HPO₄·12H₂O 62.01g和NaH₂PO₄·2H₂O 19.795g置于2L烧杯中,加入2000mL超纯水。用磷酸或氢氧化钠溶液微调至pH7.0,抽滤。
2.150mM PB缓冲盐+5%异丙醇(体积比):
按上述方法配制150mM PB缓冲盐(pH7.0)950mL,加入50mL异丙醇,超声15min。混合均匀,现配现用。
3.20mM PB缓冲盐+250mM NaCl:
称取NaH₂PO₄·2H₂O 1.59g和Na₂HPO₄·12H₂O 3.51g以及NaCl 14.61g ,加入1000mL超纯水,微调至pH7.0,抽滤 。
4.如需其他pH磷酸盐缓冲液,可以参考以下配比表,根据实际需求进行配制。
表1.不同pH的磷酸盐缓冲液配制表
*A液:0.2M NaH₂PO₄水溶液;B液:0.2M Na₂HPO₄水溶液
注意事项
1.当系统内原为缓冲盐溶液需替换为高有机相比例(纯)溶剂或系统内原为高有机相比例(纯)溶剂需替换为缓冲盐溶液时,必须先用纯水或低有机相比例溶剂(如小于20%有机相)过渡。过渡时,通常设定流速为实验流速的一半,冲洗2倍柱体积。
2.流动相最好现配现用:乙腈挥发快,易导致有机相比例变化;磷酸盐缓冲液易长霉长菌。
3.流动相一般贮存在玻璃、聚四氟乙烯容器中,不能用塑料容器贮存。
4 缓冲盐流动相连续使用一般不超过两天。
实验要领
1.过滤和脱气:
将配制好的无机盐缓冲液通过0.45μm或更小孔径水系滤膜进行过滤,以去除其中的不溶性颗粒。同时,使用超声波或真空脱气机对流动相进行脱气,以消除其中的气泡,确保色谱分析的稳定性和准确性。
2.调整pH:
合适的pH值有助于改善样品的溶解性和分离效果。通常SEC色谱柱流动相需要保持在pH7.0中。
3.色谱柱保存:
若长期不用时,SEC色谱柱建议保存在含0.02%NaN3的150mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)或20%乙醇中,以防止菌体污染。
产品介绍
在建立SEC方法时,需根据样品分子量大小、尺寸大小等信息,选择合适孔径的色谱柱,此外要根据分离目的,选择合适的粒径和填料工艺。金沙集团1862ccSEC系列色谱柱,采用特有的表面修饰技术,分离速度快,分辨率高,是分析型SEC值得信赖的产品。
图1.金沙集团1862ccSEC固定相表面修饰工艺
“-C”系列产品,采用金沙集团1862cc独有的固定相修饰工艺,硅胶表面键合一层“平躺”的单分子层,最大程度减少非特异性相互作用。适用于疏水性较强的样品,可以减少有机相的使用,“-C”系列产品安全、环保,让您的实验无后顾之忧。
金沙集团1862ccSEC系列色谱柱,分离范围广,适用于多种细分领域,下表是部分产品的分离范围。
表2.金沙集团1862ccSEC色谱柱分离范围